微生物DNA提取的原理和方法是什么？-dna提取-生
编辑： admin 2017-04-03
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细菌染色体DNA的抽提
一、 目的
熟练掌握抽提细菌DNA的一般方法
二、原理
要进行重组DNA 实验,就离不开外源基因的纯化,而外源基因主要来源之一就要直接从生物的染色体DNA上制备,所以制备高质量的染色体DNA样品经常为基因工程实验所需要,抽提细菌染色体DNA的方法目前已有许多种,这里所介绍的两种方法：一适用于枯杆菌染色体的抽提；另一种方法则适用于大肠杆菌染色体的制备.
基因工程实验所需要的基因组DNA 通常要求分子量尽可能大,以此增加外源基因获得率,但要获得大片段的DNA 非易事,细菌基因组DNA通常是个很大的环状态DNA,而在抽提过程中,不可避免的机械剪切力必将切断DNA,如果要抽提到大的DNA 分子,就要尽可能地温和操作,减少剪切力,减少切断DNA 分子的可能性；分子热运动也会减少所抽提到的DNA分子量,所以提取过程也要尽可能在低温下进行.另外细胞内及抽提器皿中污染的核酸酶也会降解制备过程中的DNA,所以制备过程要抑制其核酸酶的活性.
另外制备的细菌染色体DNA 必须是高纯度的,以满足基因工程中各种酶反应的需要,制备的样品必须没有蛋白污染,没有RNA,各种离子浓度应符合要求,这些在染色体制备时都应考虑到.
大肠杆菌染色体DNA 抽提首先收集对数生长期的细胞,然后用离子型表面活性剂十二烷基磺酸钠（SDS）破裂细胞,SDS 具有的主要功能是：（1）溶解细胞膜上的脂类和蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜；（2）解聚细胞膜上的脂类和蛋白质,有助于消除染色体DNA上的蛋白质；（3）SDS 能与蛋白质结合成为R1—0—SO3R2—蛋白质的复合物,使蛋白质变性而沉淀下来.但是SDS 能抑制核糖核酸酶的作用,所以在以后的提取过程中,必须把它除干净.以免影响下一步RNase的作用.破细胞后RNA经RNase消化除去,蛋白质经苯酚、氯仿:异戊醇抽提除去经洒精沉淀回收DNA.枯草杆菌染色体制备与上类似,但略加修改的方法要适合教学要求.枯草杆菌是格兰氏阳性菌,所以在SDS 处理前需要使用溶菌酶裂解细胞壁.溶菌酶是一种糖苷水解酶,它能水解菌体细胞壁的主要化学成份肽聚糖中的β—1,4 糖苷键,有助于细胞壁破裂,破裂的细胞壁在SDS 的作用下溶菌,同时用蛋白酶K 消化蛋白质,能解离缠绕在染色体DNA上的蛋白质,然后加入一定量的醋酸钾,使蛋白质变性,通常离心除去,在这期间可加入核糖酸酶消化RNA,最后用乙醇回收DNA.
此二种方法抽提的细菌染色体DNA,无RNA和蛋白质污染,可用于限制性内切酶消化,分子再克隆等.但在下一步实验前,要测定其DNA的浓度,常用测定DNA 浓度的方法,是溴化乙锭电泳法；当DNA 样品在琼脂糖凝胶中电泳时,加入的EB 会增强发射的荧光.而荧光的强度正比于DNA 的含量,如将已知浓度的标准样品作电泳对照,就可估计出待样品的浓度.
三、材料
（一）菌株
大肠杆菌C600、枯草杆菌BR151.
（二）仪器
电泳设备、恒温水浴锅、低速离心机、恒温振荡器、紫外检测仪.
（三）器皿
玻璃离心管（10 毫升）、移液管（10毫升、5毫升）、微量取样器、烧杯、玻璃棒、试管、三角瓶
（四）试剂
（1）LB 完全肉汤培养液：1%蛋白胨 0.5%酵母粉 0.5%NaCl pH7.5.
（2）BY 培养液：1%蛋白胨 0.5%牛肉膏 0.5%酵母粉 0.5%葡萄糖 0.5%NaClpH7.5
（3）SET 溶液：20%蔗糖；50mmol/L Tris—HCl（pH7.6） 50mmol/L EDTA.
（4）20%SDS
（5）饱和酚
（6）氯仿:异戊醇（24:1 V:V）
（7）预冷无水酒精
（8）TE 溶液
（9）RNase溶液
（10）5mol/L 醋酸钾
（11）蛋白酶K 20mg/ml
四、实验步骤
1、取大肠杆菌C600单菌落于5 毫升LB培养液中,37℃振荡培养过液.
2、将上述菌液1%接种量接种于20 毫升LB 培养液中,37℃摇床振荡培养过夜.
3、已培养好的菌液,收集于10毫升的离心管中,在低速离心机上4000r/min离心10分钟,去上清,留沉淀菌体.
4、用5 毫升的SET 溶液悬浮细胞,加入20% SDS 1毫升,37℃下轻摇过夜,使细胞裂解.
5、加入等体积的饱和酚,上下轻轻摇匀,放置5 分钟后,在低速离心机上3500r/min离心10 分钟.
6、取上相,加入1/2 体积的饱和酚,1/2体积的氯仿异:戊醇,上下翻转均匀,3500r/min离心10 分钟.
7、取上相,加入等体积的氯仿:异戊醇,如第6步,离心.
8、取上相于一干净离心管中,另在一个50 毫升的烧杯中加入15毫升预冷无水酒精,把上述的上相液沿着玻棒慢慢倒入酒精中,并温和地搅拌以使DNA 附着于玻棒上.
9、挑起DNA,再放于干净的酒精中洗涤,然后把DNA溶于50 毫升TE 中,待测浓度.
（二）枯草杆菌染色体DNA 的抽提
1、在BY 斜面上划线活化枯草杆菌BR151.
2、挑一环已活化的BR151 菌株于20 毫升的BY培养液中,37℃摇床振荡培养过液.
3、过夜培养物,收集10 毫升于离心管内,在低速离心机上3500r/min离心10 分钟.
4、沉淀菌体加入0.75 毫升溶菌酶液（8 毫克溶菌酶/1毫升SET）,振荡器上悬浮细胞,悬浮液移入1.5 毫升离心管,室温30 分钟.
5、在反应液中加入0.15毫升SDS溶液,蛋白酶K 溶液5 微升,37℃水浴10 分钟后转入75℃水浴5 分钟.
6、加入5mol/L 醋酸钾0.3 毫升,上下翻转均匀,置于冰上30 分钟,期间不时摇动.
于台式高速离心机离10000r/min10 分钟.
7、上清液移入另一离心管,弃沉淀.重复第六步.
8、上清液移入5 毫升的离心管内,缓慢加入2倍体积的无水酒精,DNA呈絮状沉淀.用一灭菌牙签,挑起DNA 沉淀,溶于50微升TE中.待检查浓度.
9、若无絮状沉,则把其置-20℃冷冻3 小时（或-70℃冷冻30 分钟）,取出离心10 分钟（10000rPm）,去上清,晾干,加入50ul TE溶解（取20ul 点样测定）.
（三）染色体DNA 制备样品浓度测定
1、按实验一方法制备琼脂糖凝胶（0.6%）
2、分别取标准浓度的λDNA 0.05ug、0.1ug、0.15ug、0.2ug,加相应的加样缓冲液混合好,点样.
3、取2 微升染色体DNA 样品点样(冷冻离心获取的DNA样品取50 微升点样),打开电泳仪电泳,待溴酚兰进入凝胶2 厘米后,停止电泳,紫外灯下观察,估计样品DNA浓度.
五、结果讨论与问题
紫外光下观察DNA 样品纯度,计算出制备的DNA总量和浓度.
1、SDS 在抽提DNA 过程有哪几个作用?
2、在本实验中未加入RNase,那么样品中应出现什么情况?
类似问题
类似问题1：柱状法提取DNA原理是什么?[生物科目]
试剂盒的胶回收柱采用特殊硅基质材料在一定的高盐缓冲系统下高效、专一地吸附DNA、RNA的原理（在高盐、低pH值情况下吸附DNA；低盐、高pH值情况下释放DNA.离心柱上含有Resin合成树脂,具有吸附DNA的功能）,配备设计独特的离心吸附柱式结构,使用常规台式高速离心机,在几分钟之内即可以高效回收核酸片段.
图1 硅胶吸附DNA示意图
图2 PH值对硅胶吸附DNA的影响
类似问题2：植物DNA提取的原理和方法是什么?[生物科目]
原理就是去掉植物细胞壁 细胞膜 质体 线粒体 叶绿体 剩下细胞核了.就是DNA了.
通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞,由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响,在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性.在液氮中研磨,材料易于破碎,并减少研磨过程中各种酶类的作用.
十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide,简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,简称SDS)等离子型表面活性剂,能溶解细胞膜和核膜蛋白,使核蛋白解聚,从而使DNA得以游离出来.再加入苯酚和氯仿等有机溶剂,能使蛋白质变性,并使抽提液分相,因核酸(DNA、RNA)水溶性很强,经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质.上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀,沉淀DNA溶于TE溶液中,即得植物总DNA溶液
类似问题3：CTAB法提取DNA的原理,[生物科目]
CTAB法原理 CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性.在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物,只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提,去除蛋白,多糖,酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来.\x0dCTAB提取缓冲液的经典配方\x0dTris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏；\x0dEDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性；\x0dNaCl 提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,在于液相中； CTAB溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离；\x0dβ-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除\x0dPVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合,有效去除多糖.\x0d使蛋白质变性,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶.蛋白分子溶于酚相,而DNA溶于水相.\x0d使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2抑制了DNase的降解作用.缺点：1.能溶解10-15%的水,从而溶解一部分poly(A)RNA.2.不能完全抑制RNase的活性.\x0d氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层.\x0d最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚.（酚易溶于氯仿中）\x0d异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡.异戊醇可以降低表面张力,从而减少气泡产生.另外,异戊醇有助于分相,使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定.\x0d用乙醇沉淀DNA时,通常要在溶液中加入单价的阳离子,如NaCl 或 NaAc,Na+中和DNA分子上的负电荷,减少DNA分子之间的同性电荷相斥力,而易于聚集沉淀.\x0d简言之,无论哪种抽提方法,药品的作用基本都是一样的
类似问题4：植物DNA提取原理?[生物科目]
通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞,由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响,在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性.在液氮中研磨,材料易于破碎,并减少研磨过程中各种酶类的作用.
十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide,简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,简称SDS)等离子型表面活性剂,能溶解细胞膜和核膜蛋白,使核蛋白解聚,从而使DNA得以游离出来.再加入苯酚和氯仿等有机溶剂,能使蛋白质变性,并使抽提液分相,因核酸(DNA、RNA)水溶性很强,经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质.上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀,沉淀DNA溶于TE溶液中,即得植物总DNA溶液.
类似问题5：盐析法提取DNA原理
DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同 利用这一特点 选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解 而使杂质沉淀 或者相反 以达到分离目的 DNA在NaCl溶液中的溶解度先增大后减小 在DNA溶解度最低时 DNA从溶液中析出 而其他杂质还留在溶液中 达到粗提取的目的